Ao fixarmos algo, prevenindo a sua movimentação, estamos fazendo uma imobilização. Em tecnologia enzimática, este termo se refere ao confinamento físico de uma enzima ou a sua localização dentro de uma região definida com a retenção das atividades catalíticas. Ao imobilizar uma enzima, algumas mudanças estruturais e conformacionais podem acontecer e consequentemente, acarretar em mudanças das suas propriedades.
Como as enzimas são extremamente sensíveis, a imobilização é uma técnica necessária para o aumento de algumas propriedades enzimáticas como estabilidade, atividade e a possibilidade de reutilização. Entretanto, a extensão das mudanças de propriedade é diretamente dependente do método de imobilização, da natureza do suporte, do agente acoplante e da especificidade dos grupos reativos. Isto faz com que haja diversos métodos de imobilização, porém, sempre afetando a atividade enzimática de alguma maneira.
Desde 1960 o uso de enzimas isoladas e imobilizadas tem sido utilizado em reatores industriais de larga escala. Hoje em dia, esforços na área de pesquisa e desenvolvimento têm sido feitos de maneira a aperfeiçoar o material dos suportes, com o objetivo de manter e /ou aumentar a atividade enzimática.
Através da imobilização, as enzimas ficam pouco suscetíveis a processos intramoleculares, como autólise, proteólise e agregação, e a enzima dentro de uma estrutura porosa não entra em contato com agentes desnaturantes, tais como bolhas e solventes imiscíveis. O uso de enzimas imobilizadas também permite a simplificação do desenho de um reator e do controle de uma reação, já que apenas retirando a enzima do contato da reação, faz com que ela pare.
Proteínas e enzimas imobilizadas têm sido utilizadas também em aplicações biomédicas. Estas aplicações incluem o uso de anticorpos ou antígenos imobilizados para cromatografia com bioafinidade e também o uso de receptores ou ligantes imobilizados para o estudo de suas interações com células e biosensores.
Deve-se ter em mente que para cada tipo de suporte existe uma gama de possibilidades de procedimentos de imobilização. Dentre os métodos de imobilização estão os reversíveis e os irreversíveis:
As imobilizações irreversíveis previnem a lixiviação da enzima durante as reações, porém quando a enzima se desativa, o suporte deve ser jogado fora juntamente com a enzima, enquanto nas imobilizações reversíveis, há a possibilidade de recuperar os suportes após a inativação da enzima.
A ligação covalente à superfície, o aprisionamento dentro de uma matriz e a micro-encapsulação se caracterizam como imobilizações irreversíveis. Para a ligação covalente, o suporte deve possuir um grupo reativo como, por exemplo, amina, carboxilato e tiol, ou deve ser ativado de maneira a realizar a imobilização. O pré-requisito para a imobilização direta em superfícies magnéticas é a ativação das ligações Fe-OH com 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Se a superfície está coberta de funções ácido carboxílico, este tipo de ativação também é necessária, resultando em ligações estáveis do tipo amida entre o suporte e a enzima.
Quando o suporte possui aminas, o simples uso de um agente reticulante, como gluteraldeído resulta na formação de ligações imina entre a biomolécula e o suporte. A redução destas ligações imina pode ser feita a partir do uso de uma solução de borohidreto de sódio para obter ligações amina.
A um suporte epoxidado, a reação ocorrerá com aminas, hidroxilas e sulfetos presentes na superfície da enzima. Este método normalmente proporciona bastante estabilidade às proteínas devido ao fato de elas serem imobilizadas por múltiplos pontos à superfície do suporte.
Pode-se também utilizar o co-aprisionamento de partículas magnéticas e enzimas em uma matriz polimérica. O ponto negativo deste tipo de sistema é a diminuição da transferência de massa, porém, por outro lado, há uma menor desnaturação das enzimas.
Outra metodologia envolve a micro-encapsulação, em que, através de rotas sintéticas meticulosamente pensadas, há o aprisionamento das enzimas no núcleo de partículas magnéticas poliméricas, obtendo-se um biocatalisador extremamente estável.
Já para as imobilizações reversíveis, o método mais fácil é a adsorção das enzimas à superfície do suporte, pois o DG diminui com a adsorção, sendo um processo altamente entrópico. As interações entre nanopartículas e enzima são basicamente por pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals ou interações hidrofóbicas. A desvantagem deste método de imobilização é que o processo de adsorção é altamente afetado por pH, força iônica, temperatura e polaridade do solvente.
A ligação iônica também pode ser utilizada para se obter um sistema reversível de imobilização. Utilizando-se ligantes iônicos poliméricos podemos modular as interações entre proteína e matriz, porém, como as cargas estão muito próximas às enzimas, a cinética pode se distorcer como resultado da partição ou devido ao fenômeno de difusão, mudando o pH ótimo de reação ou a estabilidade quanto ao pH.
Ligações por afinidade como entre estreptavidina e biotina são muito utilizados em métodos de imobilização para se obter partículas magnéticas para imunoensaios. Alguns trabalhos também utilizam inibidores enzimáticos como uma maneira de purificar uma mistura complexa de enzimas.
Outro método que utiliza a afinidade é composto do uso de uma camada de ouro em volta de partículas magnéticas. A afinidade entre partícula e suporte se dá pelos resíduos de cisteína através da sua ligação na superfície do suporte.
Dentre os métodos reversíveis de imobilização está a quelação, em que utilizando Cu2+ ou Ni2+ coordenado ao suporte, pode-se coordenar a superfície enzimática ao metal. Neste caso, a adsorção não é uniforme e há a possibilidade de lixiviação dos metais, diminuindo a reprodutibilidade destes sistemas.
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- Texto Retirado da Tese de doutorado de Marques Netto, C. G. C., Universidade de São Paulo, 2013